最大的差異在於「是以試片表面射出的訊號來觀察，還是讓電子穿透試片來觀察」。SEM 以聚焦極細的電子束掃描試片表面，偵測從表面射出的二次電子等，因此厚試片或整片晶圓都能直接觀察表面形狀，解析度大約在1nm左右。TEM 讓高能量電子穿透已薄化至厚度100nm以下的試片，可得到能看見原子排列的0.1nm以下解析度，但試片製備耗時，觀察過的試片也無法再作為產品。在半導體領域的分工是：產線上的尺寸量測與缺陷觀察用 SEM，在原子層級確認閘極絕緣膜厚度或界面的製程開發與故障分析則用 TEM。
主要差異
| 比較項目 | SEM（掃描式電子顯微鏡） | TEM（穿透式電子顯微鏡） |
|---|---|---|
| 觀察原理 | 以電子束掃描表面，偵測表面射出的二次電子與背向散射電子並成像 | 讓電子束穿透薄片試片，將穿透電子或繞射電子成像 |
| 可得知的資訊 | 表面凹凸與形狀、剖面形狀、組成造成的對比 | 內部結構、晶格影像、界面、晶體缺陷 |
| 解析度參考值 | 1nm左右（依設備與觀察條件而定） | 0.1nm以下（具像差校正者更高） |
| 加速電壓 | 數百V～30kV左右 | 80～300kV左右 |
| 試片厚度 | 無限制，整片晶圓也能觀察 | 需要電子能穿透的100nm以下薄片 |
| 試片製備 | 表面觀察多半不需要；剖面以劈裂或 FIB 加工 | 必須以 FIB 等進行薄化，屬於以數小時計的作業 |
| 破壞性・非破壞性 | 低加速電壓的線上設備可讓晶圓回到製程 | 破壞性，觀察過的部位無法成為產品 |
| 觀察範圍 | 可從大視野到高倍率連續搜尋 | 僅限於薄化後的狹小區域 |
| 半導體中的主要用途 | 以 CD-SEM 量測線寬、以 Review SEM 觀察缺陷、剖面觀察 | 閘極堆疊的膜厚與界面評估、GAA 結構確認、故障分析 |
| 搭配的分析 | EDX（能量散佈 X 射線分析） | STEM、EDX、EELS（電子能量損失能譜） |
表面射出的訊號，還是穿透的電子
SEM 是將聚焦到數nm的電子束在試片表面以光柵狀掃描。電子照射到的點會射出二次電子或背向散射電子，逐點記錄其數量來組成影像。二次電子只會從表面極淺的部分射出，因此得到的影像強烈反映表面凹凸。TEM 則是先把試片薄化到電子能夠穿透的程度，再讓高能量電子束穿透。以透鏡將被試片內部原子散射、繞射的電子成像，因此看到的不是表面，而是沿厚度方向投影的內部結構；條件齊備時，原子列本身會以晶格影像的形式呈現。
能在製造產線上使用的是 SEM
量產線上日常使用的電子顯微鏡屬於 SEM 系列。CD-SEM 在不劈裂晶圓的情況下，從上方量測光阻或蝕刻後的圖形線寬。其特徵是為了避免電子束造成的損傷與充電效應，會把加速電壓降到1kV左右以下來觀察。Review SEM 則移動到光學式等缺陷檢測設備所找到的缺陷座標，將其形狀放大並分類。兩者量測後的晶圓都能直接回到製程。TEM 在薄化試片時就要切下晶圓的一部分，因此無法納入產線的製程管理。
需要 TEM 的場合
當閘極絕緣膜或 GAA 的奈米片厚度只有數nm時，以 SEM 的解析度，膜的邊界會變得模糊，無法判斷正確的厚度與界面狀態。High-k 膜與界面層的厚度、金屬閘極的填充狀況、磊晶層的晶體缺陷等資訊，只有具備原子級解析度的 TEM 才能確認。以聚焦電子束掃描的 STEM 模式搭配 EDX 或 EELS，就能在同一位置疊合觀察結構與元素分布。在新製程的條件設定，以及以物理方式找出電性不良原因的故障分析中，TEM 是最終的確認手段。
瓶頸在於試片製備
TEM 在實務上的限制，與其說在觀察本身，不如說在試片製備。以 FIB（聚焦離子束）挖出包含目標電晶體的區域，再薄化到數十nm的厚度，需要熟練的作業且耗時數小時。若在薄化過程中形成離子束造成的損傷層，這層本身就會扭曲觀察結果。因此一般的做法是先以 SEM 觀察大範圍、縮小異常位置，鎖定目標後再製作 TEM 試片，依此順序組合兩者。將 FIB 與 SEM 整合在1台設備中的 FIB-SEM，就是為了在同一設備內完成這種範圍縮小與試片製備。
總結（該選哪一種）
若想在不破壞晶圓的情況下大量量測形狀或尺寸，或想搜尋並分類缺陷，就用 SEM。若想在原子層級確認膜厚、界面或晶體結構，或想查明不良的物理原因，就用 TEM。判斷的關鍵不只是解析度，還在於「試片能否破壞」與「能花多少時間」。